Metodi per la separazione delle proteine
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Metodi per la separazione delle proteine
Elettroforesi
(+) anodo
(-) catodo
Tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche per effetto di un campo elettrico.
Elettroforesi
Classificazione delle tecniche
Le tecniche elettroforetiche si classificano in:
· elettroforesi priva di carrier, in cui gli ioni migrano in una soluzione tampone
· elettroforesi mediante carrier, più comunemente utilizzata, in cui gli ioni migrano su un supporto di carta, un gel o un polimero
· elettroforesi classica (es. separazione delle proteine del siero)
· elettroforesi capillare
ELETTROFORESI
Le proteine
La loro carica dipende da:
· Punto isoelettrico
Valore di pH al quale la proteina è scarica (carica netta uguale a zero)
· pH del mezzo
Le proteine possono essere separate in funzione del loro punto isoelettrico per elettroforesi
PARAMETRI CHIAVE
· L’elettroforesi è dunque il processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilità
· I fattori che influenzano la mobilità di una molecola in un campo elettrico comprendono la carica della molecola (q), il gradiente di voltaggio del campo elettrico (E), la resistenza di attrito del mezzo di supporto (f)
· Il prodotto dei parametri q ed E (q x E) fornisce la forza, misurata in newton, che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica opposta
PARAMETRI CHIAVE
· La forza frizionale f, la quale rallenta il movimento della molecola carica, dipende dalle dimensioni della molecola, dalla sua forma, dalle dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene l’elettroforesi e dalla viscosità del tampone
· La velocità (v) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico è data dunque dalla seguente equazione:
ELETTROFORESI – principi generali
Per la legge di Joule in un sistema elettrico caratterizzato da una resistenza R e nel quale viene fatta passare una corrente I si sviluppa sotto forma di calore una potenza che è data da
W = VI = I2R
cosa provoca il calore in un sistema del genere?
a) Moti convettivi nel sistema
b) Aumento diffusione molecole
c) …
}
Effetto negativo sulla separazione delle molecole – Risoluzione -
ELETTROFORESI
Velocità di migrazione
La variabili che influenzano la velocità di migrazione sono:
- campo elettrico E= V/d;
- carica q della particella;
- coefficiente d’attrito f
- (
dimensioni molecolari)
v = E q/ f
La velocità di migrazione dipende dunque dalla differenza di potenziale e dal rapporto carica raggio (q/r).
Si definisce mobilità elettroforetica: μ=v/E (cm2/volt x sec)
Fattori che influenzano la velocità di migrazione
· CAMPIONE
Carica
Dimensioni
Forma
· TAMPONE
Concentrazione (forza ionica)
pH
· SUPPORTO
Adsorbimento
Filtrazione molecolare
In soluzione alcalina il gruppo carbossilico segue la reazione:
COOH + OH- → COO- + H2O
La proteina avrà una netta carica negativa.
In una soluzione leggermente acida, il gruppo amminico :
NH2 + H+ → NH3+
Gli ioni NH3+ danno alla molecola una carica nettamente positiva.
Per le EF delle sieroproteine si impiega un tampone a pH alcalino che conferisce ai polipeptidi una carica negativa rendendole solubili senza sottoporle a denaturazione.
ELETTROFORESI
Tipi di molecole separabili
· amminoacidi
· peptidi
· PROTEINE
· acidi nucleici
· ioni inorganici
· acidi e basi organiche
· intere cellule
Indicazioni per la Richiesta di Elettroforesi Siero-Proteica
Documento Gruppo di Studio PROTEINE SIBioC - Approvato dal Gruppo di Studio PROTEINE SIMeL
APPLICAZIONI IN BIOCHIMICA CLINICA
Evidenziare alterazioni
del pattern proteico???
Rivelare la presenza
BREVE STORIA
1937 Elettroforesi sieroproteica in fase libera
Blessum C .Hirumi E .Bullard W. Overview of clinical protein electrophoresis: past and present.
Arne Tiselius,
Nobel per la Chimica 1948
Elettroforesi della sieroproteine
Tiselius per primo mise a punto una tecnica in fase libera. La migrazione delle proteine avveniva in una soluzione tampone contenuta in un tubo ad U, alle cui estremità veniva applicata una ddp. La tecnica complessa, lunga e poco standardizzabile fu sostituita dall’elettroforesi zonale, su supporto solido.
SUPPORTI
Non setaccianti
(Carta), acetato di cellulosa
Setaccianti
Gel di poliacrilammide (PAG)
Agarosio
Elettroforesi nella MdL
Diversi tipi di elettroforesi
· Elettroforesi zonale · Rapporto carica/
(Gel di agarosio, Acetato di cellulosa, gel di poliacrilammide (PAG)) raggio
· PAGE-SDS · Solo dimensione
· Focalizzazione isolelettrica · Solo carica (pI)
· Elettroforesi bidimensionale · Carica e dimensione
separatamente
Elettroforesi nella MdL
Applicazioni
· Proteine sieriche ed urinarie
· Immunofissazione
· Emoglobine
· CDT
· Isoelettrofocalizzazione delle IgG liquorali
· Isoenzimi
· Lipoproteine
Elettroforesi zonale
Dopo l’elettroforesi è possibile l’identificazione di “zone” differenti e separate tra di loro dove migrano una o più proteine
}
γ
F. Aguzzi, D. Fenili, N. Montalbetti, C. Petrini, F. Salvatore, M. Tarantino
Raccomandazione ufficiale della Commissione SIBioC - L’elettroforesi delle sieroproteine 1° Biochimica Clinica 9; 1985
Elettroforesi zonale
Indicazioni del test
Ricerca, monitoraggio e dosaggio di componenti monoclonali
Rilevazione di varianti genetiche delle proteine (es. α1-antitripsina)
Rilevazione di varianti indotte delle proteine (es. bisalbuminemia)
Valutazione di variazioni dell’assetto proteico globale
Le disprotidemie possono verificarsi in presenza di normoprotidemia, quindi con una concentrazione proteica totale nella norma, oppure con una ipo- od una iperproteinemia.
Elettroforesi zonale su supporto solido
Principio di funzionamento
Rivelazione del segnale: colorazione e lettura densitometrica.
Polimero di D-galattosio
e
3,6 anidro L-galattosio
Transizione di stato
(macroreticolo sulla base di legami idrogeno)
Transizione gel-sol tramite riscaldamento
Agarosio modificato mediante aggiunta di gruppi CH3 sui gruppi OH ha temperature di transizione minori (low melting agarose)
Reticolo di agarosio polimerizzato
“setaccio molecolare”
Elettroendosmosi
· I supporti porosi sui quali si effettua l’elettroforesi acquisiscono sempre una carica che genera un trasporto di acqua in direzione degli elettrodi.
· Nel caso delle sieroproteine a pH 8-9 si ha un evidente effetto elettroendosmotico relativo alle gammaglobuline, che cariche negativamente non migrano verso l’anodo, ma in direzione opposta, perché intrappolata dagli ioni H3O dell’acqua.
Considerazioni sull’elettroforesi
· Aumentando la forza ionica e quindi la conc. di un campione, aumenta la corrente trasportata e l’intensità, con conseguente aumento dell’effetto Joule.
· La forza ionica scelta deve essere un compromesso tra lunghezza del tracciato, risoluzione delle bande e sviluppo del calore
· I tamponi usati in lab. Hanno una forza ionica tra 0,05 e 0,10.
Elettroforesi su supporto solido
Supporti
Acetato secco
Metodo di colorazione: Rosso Ponceau
Elettroforesi su supporto solido
Supporti
Gel d’agarosio
Metodo di colorazione: Blu Acido
Acetato di cellulosa
· Usato in analisi cliniche di routine
proteine seriche
lipoproteine
ricerca di immunoglobuline anomale
· Risoluzione modesta; tempi brevi, bassi costi
· Oramai sostituito dall’agarosio
Elettroforesi su supporto solido
Coloranti
C.M. IgGK da 11 g/L
1:80= 0.138 g\L
1:300 = 0.037 g\L
1:375 = 0.029 g\L
ROSSO PONCEAU
AMIDOSCHWARTZ
VIOLETTO ACIDO
Elettroforesi su supporto solido
Agarosio Vs acetato
· Migliore risoluzione
· Non necessita transparentizzazione
· Colorazione con Acid Blue più sensibile del rosso Ponceau
· Supporto più versatile per passaggi successivi (p.es. reazioni enzimatiche)
L’agarosio è un supporto più sensibile,
risolutivo e versatile rispetto all’acetato di cellulosa
Elettroforesi su supporto solido
Limiti dei metodi
Quantificazione
· Diversa affinità delle proteine per il colorante
· Intervallo di linearità della lettura densitometrica limitato
Automazione
· Metodo semi-automatico
Elettroforesi zonale
Fase libera
Elettroforesi zonale in fase libera
L’elettroforesi capillare…
Dagli anni ‘80 l’elettroforesi capillare (su strumenti mono-capillare) è utilizzata nei laboratori di ricerca per numerose applicazioni.
Una decina di anni più tardi è stato possibile sviluppare una tecnica più adatta all’analisi di routine grazie a:
-Utilizzo di più di un capillare
-Migrazioni rapide
-Identificazione positiva dei campioni
-Completa automazione
L’elettroforesi capillare
La strumentazione necessaria per l’elettroforesi capillare è costituita da due soluzioni tampone, il capillare con dispositivo di raffreddamento, un generatore di energia ad alta tensione, un sistema per l’applicazione del campione e un rivelatore
Si utilizzano rivelatori UV, UV-DAD, fluorimetrici, elettrochimici e a spettrometria di massa
Versioni della CE
L’elettroforesi capillare comprende una famiglia di tecniche che hanno caratteristiche operative e di separazione alquanto diverse:
· elettroforesi capillare di zona (CZE): è la forma più semplice di CE, in cui le molecole sono separate in base alle differenze nel rapporto massa/carica
· elettroforesi capillare ad alta prestazione (HPCE): evoluzione della CE tradizionale
· elettroforesi capillare a gel: è l’adattamento della tecnica tradizionale di elettroforesi su gel operata su un capillare contenente un mezzo anticonvettivo come la poliacrilamide
· focusing isoelettrico (IEF): molecole cariche migrano in un campo elettrico nel quale un gradiente di pH le porta al loro punto isoelettrico
· isotacoforesi (ITP): le particelle migrano nel campo elettrico alla stessa velocità
· cromatografia capillare elettrocinetica micellare (MECC): l’addizione di sostanze in grado di formare micelle permette la separazione di molecole neutre (es. fenoli)
Elettroforesi zonale in fase libera
Flusso elettroendosmotico
Ricerca componenti monoclonali
Breve storia
Immunoelettroforesi
· L’IEF, introdotta da Grabar e Williams, ha permesso di individuare nel sangue più di 50 proteine.
IMMUNOFISSAZIONE (IFE)
FASE SEPARATIVA
ELETTROFORESI
IN FASE SOLIDA
+
Anticorpi anti-catene
γ α μ δ ε κ λ
FASE IMMUNOLOGICA
Sensibilità 0.005 g/L
IMMUNOFISSAZIONE
Alper CA, Johnson AM. Immunofixation electrophoresis: a technique for the study of protein polymorphism. Vox Sanguinis 1968: 17: 445-52
elettroforesi
Incubazione con
antisieri specific
Lavaggio
Colorazione
Elettroforesi su gel SDS-agarosio
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
Quando si applica un campo elettrico di corrente continua a una soluzione a pH determinato che contiene proteine, queste si muoveranno verso uno dei due elettrodi, ognuna con direzione e velocità determinate dalle proprie cariche superficiali e dimensioni.
La poliacrilammide (PAG) deriva dalla co-polimerizzazione radicalica
di acrilammide e di un agente reticolante, il “Bis”
PAGE: procedura
· Preparazione del gel (“casting”)
- continuo
- discontinuo (“disc ”)
- a gradiente
· Preparazione del campione
· Corsa elettroforetica
· Rivelazione
· (Recupero)
CORSA ELETTROFORETICA SU GEL DI POLIACRILAMIDE
La migrazione delle proteine all’interno del gel avviene in base al loro peso molecolare; le proteine a basso peso molecolare migrano con maggiore velocità.
L’utilizzo di uno standard, costituito da proteine con peso molecolare noto, permette l’individuazione del peso molecolare delle proteine contenute nel campione che si vuole analizzare.
Le frazioni separate dopo la migrazione sono facilmente rivelate colorando le strisce e le proteine mediante Rosso Ponceau, colorante anionico che reagisce con i gruppi amminici delle proteine in soluzione acida.
WESTERN BLOT
Tecnica di separazione analitica delle proteine sulla base del loro peso molecolare, ottenuta mediante elettroforesi in un gel denaturante di poliacrilamide
Permette di valutare la presenza di una specifica proteina, matura o in forma di precursore, all’interno di un campione
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Proteina con due subunità, unite da un ponte disolfuro
Proteina denaturata. Le molecole di SDS, cariche negativamente, ricoprono la superficie della proteina
PAGE discontinuo
Sopra al gel di separazione si prepara uno “stacking” gel (di impaccamento) con:
· maglie larghe
· pH più basso
pH 6.8
pH 8.8
Gel in gradiente di concentrazione
T % crescente
BLOTTING
Trasferimento di macromolecole su di una membrana immobilizzante
GEL
MEMBRANA
Blotting: vantaggi
· La membrana immobilizzante (nitrocellulosa, nylon, PVDF (polivinilidene difluoruro)…) evita la diffusione
· Rivelazione più rapida rispetto al gel
BLOTTING
· Southern DNA
- da Edward Southern, 1975
· Northern RNA
· Western proteine (Towbin, 1979)
· Eastern ? ? ?
Eastern: this is the direct opposite to Western Blotting where you inadvertently connect the power the wrong way round on your gel tank and transfer the proteins from the gel to the tank buffer. Not a recommended protocol."
BLOTTING
· Per diffusione
· Capillare
· Sotto vuoto
· Elettroblotting (soprattutto per proteine)
Southern Blot (per capillarità)
ELETTROBLOTTING
Il blottaggio consiste nel trasferimento delle proteine dal gel di poliacrilamide su un supporto rigido, quale una membrana di nitrocellulosa, di nylon o di carta. Il gel e la membrana vengono orientati in modo tale che le proteine, cariche negativamente, migrando dal catodo verso l’anodo, si leghino al supporto rigido. Il trasferimento avviene in camera umida a voltaggio costante.
Immunoblotting: rivelazione
· Anticorpi secondari marcati con enzimi
· Marcatura fluorescente o chemi-luminescente (ECL)
· Anticorpi secondari biotinilati
· Anticorpi secondari marcati con oro
· Proteina A radioattiva
· Lectine (per glicoproteine)
INDIVIDUAZIONE DELLA PROTEINA RICERCATA
Isoelectric focusing (IEF)
IEF e un metodo per separare le proteine
secondo il loro punto isoelettrico
In un gradiente di pH e in presenza di un campo elettrico le proteina migreranno
fino a raggiungere il punto nel gradiente dove la loro carica è nulla:
Cioè al loro Punto isoelettrico
FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA
Formazione del gradiente di pH nella focalizzazione isoelettrica
Il gradiente di pH è formato dall’ introduzione nel gel di composti conosciuti come “anfoliti”, che sono miscele complesse di acidi poliammino-policarbossilici sintetici.
Si tratta di molecole a basso peso molecolare che possono reagire sia da acidi che da basi, e che migrano in un campo elettrico fino a raggiungere il proprio punto isoelettrico, producendo il gradiente.
A. Nessun voltaggio applicato
B. Gli anfoliti e le proteine si muovono quando la corrente e’ applicata secondo la loro carica
C. Al pH isolelettrico le proteine sono “focused”cioè ferme
2-DE (Elettroforesi bidimensionale)
· “Prima dimensione”: IEF
Separazione per pI (punto isoelettrico)
· “Seconda dimensione”: SDS-PAGE
separazione per massa molecolare
MAPPA PROTEICA
ID=IEF. Le proteine vengono assorbite su strisce di gel secchi che hanno gradienti di pH immobilizzati. Una volta idratate e applicato il campo elettrico le proteine acide che si trovano sul lato alcalino del gel dissoceranno e saranno caricate negativamente. A causa del campo elettrico queste proteine migreranno al polo positivo (il lato acido del gel).
2D=SDS-PAGE
Proteomica: utilizzo dei gel bidimensionali associati
all’analisi di spettrometria di massa
Il proteoma può essere visualizzato tramite elettroforesi su gel bi-dimensionali (2D-gel) e le proteine di interesse possono essere identificate tramite tecniche di spettrometria di massa
Con l'apparecchiatura attualmente disponibile è possibile reproducibilmente separare proteine che differiscono soltanto in 1 unità di pH in 24 centimetri di corsa.
La spettrometria di massa (MS-Maldi-TOF) é oggi il metodo piu’ comunemente usato per determinare la sequenza aminoacidica di proteine
Spettrometria di massa
· Separazione di ioni in fase gassosa secondo il rapporto carica/massa
· Fasi dell’analisi
introduzione del campione
ionizzazione (MALDI o ESI)
separazione (TOF o ION-TRAP)
rivelazione
elaborazione
Spettrometria di Massa
MS-MALDI TOF
- Le molecole di campione sono convertite in ioni gassosi
- gli ioni sono poi accelerati in un campo elettrico o magnetico o viene misurato il TOF di ioni di massa diversa in una data distanza
- separati da un’analizzatore di massa-carica (m/z)
- il rivelatore determina il rapporto massa/carica di ogni specie ionizzata
TOF=Time of Flight
Tempo impiegato da ioni di massa diversa per percorrere un data distanza
MALDI-TOF
(Ionizzazione per desorbimento laser assistito da una matrice)
Time of flight mass spectometer
Analisi elettroforetica
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