Proteinuria di Bence Jones
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Proteinuria di Bence Jones:
valutazione delle migliori tecnologie analitiche
Cenni di Fisiopatologia
Anatomia del rene
Il nefrone: unità funzionale di base del rene
I vasi sanguigni del nefrone
Il glomerulo
Il glomerulo
· La filtrazione del plasma avviene attraverso la Membrana Basale Glomerulare (MBG)
· Le cellule endoteliali glomerulari sono fenestrate
· I pedicelli dei podociti sono a contatto con la MBC
· La filtrazione del plasma produce un ultrafiltrato nello spazio di Bowman
I tubuli
Fisiologia del nefrone e proteine
albumina
transferrina
immunoglobuline
microproteine
albumina
transferrina
immunoglobuline
microproteine
microproteine
Filtrazione glomerulare
Riassorbimento tubulare
Secrezione tubulare
(Tamm-Horsfall protein)
Urina definitiva con 1/3 di albumina
e 2/3 di globuline
Le urine definitive sono il risultato dell’ultrafiltrazione glomerulare e del riassorbimento tubulare
In condizioni fisiologiche, questi processi impediscono la perdita indesiderata di proteine nelle urine
Interesse diagnostico dell’elettroforesi delle proteine urinarie
· Ricerca e tipizzazione delle catene leggere libere monoclonali nelle urine o proteina di Bence Jones e delle Componenti Monoclonali intere (valutazione dello stadio di avanzamento di una gammapatia monoclonale, prevenzione di problemi legati all’azione nefrotossica della PBJ).
· Ricerca e caratterizzazione di proteine ad alto e/o basso peso molecolare per la definizione del danno renale (pre-renale, glomerulare, tubulare, post-renale).
Cause dell’aumento della proteinuria
· Fisiologica: intermittente (ortostatica, post-prandiale, sforzo, stress)
· Pre-renale: ipertensione, ipertermia, problemi cardiaci o epatici,… Alta concentrazione proteica (proteinuria da sovraccarico)
· Renale: danno glomerulare , tubulare (o entrambi)
· Post-renale: danno al tratto urogenitale
Proteinuria mista
La proteina di Bence Jones:
il primo marcatore di neoplasia nella storia della Medicina
· Henry Bence Jones (1813-1873) era medico al St. George’s Hospital a Londra.
· Nel 1845 ricevette un campione di urina da un paziente affetto da “mollities ossium”, nel quale evidenziò una proteina che, a differenza dell’albumina, era solubile in acido nitrico bollente. Nel 1847 descrisse la scoperta di tale nuova proteina [Phil Trans R Soc Lond 1848;138:55].
· La origine metabolica di tale proteina, e la natura neoplastica della malattia (mieloma multiplo) associata alla presenza di tale proteina nell’urina, vennero chiarite in seguito.
Proteina di Bence Jones
Cristallografia di Catena leggera
Catene leggere Libere Monoclonali
Proteina di Bence Jones
· Normalmente le plasmacellule producono un eccesso di catene leggere rispetto all'aliquota montata sulle catene pesanti.
· Queste catene leggere policlonali vengono filtrate in modesta quantità (da 3 a 4 mg/die) attraverso il filtro renale e riassorbite in parte dal tubulo contorto prossimale, sede del catabolismo delle proteine a basso peso molecolare.
Proteina di Bence Jones
Proteina di Bence Jones
· Quando essa è prodotta in grande quantità come nelle patologie neoplastiche, può risultare dannosa nei confronti del tubulo renale, configurando con il tempo, vari gradi di compromissione renale.
· La BJ e' evidenziabile mediante elettroforesi urinaria; si presenta come una banda netta a localizzazione molto variabile dovuto alla sua grande variabilità molecolare con monomeri con peso di 22 kda dimeri di circa 44 kda e frammenti con peso da 5-18 kda.
Proteina di Bence Jones
E.F. delle Urine.
Presenza di Bence Jones.
La diversa dislocazione delle proteine indica diversi gradi di polimerizzazione
PATOLOGIE ASSOCIATE A PROTEINA DI BJ
La proteinuria di BJ può manifestarsi in diverse situazioni patologiche:
mieloma multiplo
macroglobulinemia di Waldenström
amiloidosi
malattia da deposizione di catene leggere.
Meno frequente è la presenza di proteinuria di BJ nei linfomi e nelle leucemie linfatiche croniche. Raramente si manifesta in associazione con neoplasie non linfoproliferative.
APPROPRIATEZZA
Un esame è appropriato quando il test ha la capacità di modificare l’outcome
o la decisione medica Learning Organization
· L’appropriatezza è un termine relativamente nuovo nella cultura sanitaria e ancor più per quella giuridica in particolare nel nostro paese. E’ diventata in breve tempo un principio guida ed un obiettivo prioritario per i Servizi Sanitari in un’ottica di razionalizzazione e di ottimizzazione della spesa sanitaria.
· Il termine “appropriatezza” entra nell’ambito sanitario italiano per la prima volta nel 1998 con la seguente citazione nel Piano Sanitario Nazionale 1998-2000: “L’ampia variabilità nella risposta assistenziale rinvia a problemi di appropriatezza nell’utilizzazione delle risorse e a potenziali iniquità nell’accesso e nella utilizzazione dei servizi sanitari”.
APPROPRIATEZZA
APPROPRIATEZZA VUOL DIRE
· fare le cose giuste
· al momento giusto
· nel modo migliore
· per chi ne ha bisogno
· con competenza clinica
(clinico, patologo clinico, paziente)
La proteina di Bence Jones: indicazioni
Soggetti con gammapatia monoclonale sierica:
al riscontro e ad ogni successivo controllo
Sospetto clinico o laboratoristico
(es. ipogammaglobulinemia non attesa in soggetto adulto) di malattia da catene leggere
Sospetto clinico di amiloidosi o di malattia da deposizione di catene leggere
Aspetti analitici
Campione
URINE in toto
o conc.
Campione
- La proteina di BJ è facilmente degradata dalla flora batterica presente in vescica, per cui per la ricerca qualitativa è importante utilizzare urine che abbiano soggiornato in vescica il meno possibile.
- Il campione di elezione è dunque costituito da urine fresche, (consigliato il secondo campione del mattino, raccolto tra le ore 6 e le ore 9); se il campione è delle 24 ore, si deve aggiungere sodio azide (1%) al fine di limitare la proliferazione batterica.
· L’urina può essere utilizzata come tale se si dispone di un metodo di sufficiente sensibilità; in caso sia clinicamente indicato ricercare la proteina di BJ con la maggiore sensibilità possibile, può essere necessario concentrare il campione.
Concentrare
Nel linguaggio chimico riferito a materie sciolte e diffuse per restringerle in un minor volume mediante tecniche chimico-fisiche.
www.etimo.it (dizionario etimologico on line)
Metodi per concentrare liquidi biologici
DIALISI
PRECIPITAZIONE CHIMICA
EVAPORAZIONE
ESSICCAZIONE
LIOFILIZZAZIONE
ULTRAFILTRAZIONE
Limiti
Le tecniche, ora citate, possono presentare una serie di difficoltà che sono riassumibili nel modo seguente:
COSTO ELEVATO
TEMPI OPERATIVI LUNGHI
VARIAZIONE CHIMICA O CHIMICO FISICA DEL\DEI COMPONENTI
PERTURBAZIONE DEL LIQUIDO BIOLOGICO
PERDITA DELLA ATTIVITA’ BIOLOGICA
PERDITA DI MOLECOLE PER TAGLIO DELLA POROSITA’ DELLA MEMBRANA
Le problematiche della tecnica : come concentrare?
· Stabilire la sensibilità del proprio sistema
· Concentrare sempre un numero di volte circa uguale le urine, ma non superiore a 10 volte.
· Sensibilità SIBioC per la ricerca della BJ: almeno 10 mg/L
· Sensibilità metodo agarosio circa 6-12 mg/L
· Selezionare porosità uguali o inferiori a 10.000 D
· Concentrare a temperatura controllata
Le problematiche della tecnica per ultrafiltrazione statica:Limitazioni nel recupero del soluto
· Misure qualitative
· Perdita soluto per legami aspecifici
· Perdita soluto per dimensione pori
· Alte concentrazioni non utili per basso recupero
Concentratori in ultrafiltrazione per centrifugazione (Vivaspin)
I vantaggi della concentrazione per ultracentrifugazione sono:
· Taglio molecolare di 5 kDa
· Assenza della polarizzazione della concentrazione
· Riduzione di ritenzione di tipo dipolo-dipolo
· Notevole riduzione dei fenomeni diffusivi e maggiore indice di recupero del soluto.
Principio del metodo in Adsorbimento
Fenomeno per cui la superficie di una sostanza solida, detta adsorbente, fissa molecole provenienti da una fase liquida o gassosa con cui è a contatto.
Per superficie si deve intendere non solo quella esterna, ma anche quella interna dei canalicoli capillari, delle fratture, ecc. (Enc. Treccani)
Adsorbente
· Gel di silice in forma granulare che rappresenta il letto adsorbente.
Concentrazione
Basetta in lega metallica deputata a contenere il campione biologico (urina, liquor, ecc..) in quantità nota (120 μl)
CONCENTRATORE a T costante a gel di Silice
Ricerca e tipizzazione della proteina di Bence Jones
Per screening si intende un intervento su una particolare popolazione inteso alla presuntiva identificazione di una malattia non conosciuta mediante l’applicazione di test semplici e rapidi.
RICERCA
Metodo
Il metodo più usato in molti laboratori prevede una elettroforesi di screening ed una immunofissazione successiva atta a verificare che si tratta di catene leggere libere.
Limite del metodoElettrof.<sensibile IEF
Sensibilità 0.029 g\L
Sensibilità 0.005 g/L
VIOLETTO ACIDO
VIOLETTO ACIDO
Proteina di Bence Jones
L’immunofissazione è il «gold Standard», termine tecnico che applicato al campo medico indica un materiale, un farmaco, una tipologia d'esame, un trattamento medico o chirurgico come il più affidabile.
Nel nostro caso amplifica la sensibilità e permette di rilevare quantità di
PBJ di lieve entità ma clinicamente significative.
IMMUNOFIXATION
electrophoresis
incubation with
monospecific antisera
IFE PENTA
Nella prima corsia è mostrata il tracciato elettroforetico, mentre nella seconda corsia è stato utilizzato l’antisiero pentavalente (antisiero con Ig γ α μ e le catene κ e λ)
Tracciato 1
Presenza di proteinuria
Con C.M. neg
Tracciato 2
Assenza di proteinuria
Con C.M. positivo
Tracciato 3
Alb. + tracce
Neg.C.M.. In EP
Tracciato 4
Tracce Alb.
Neg. C.M.in EP
Istogramma delle frequenze della relazione tra B.J.-IFE e URINE-HRE
Istogramma delle frequenze della relazione tra B.J.-IFE e PENTA-IFE
DATI INTERNI Basile U. et al
DATI INTERNI Basile U. et al
IFE PENTA
· La ricerca delle C.M. nelle urine ha dimostrato come anche la migliore elettroforesi proteica sia in alcuni casi incapace di mostrare la presenza di componenti monoclonali.
· L’IFE PENTA ha dimostrato un’ ottima sensibilità, una facilità di esecuzione, nonché dei costi contenuti tali da rendere quanto prima questa tecnica screening necessario per la ricerca di componenti monoclonali nelle urine.
Nuovo Metodo BIOCI – BJTSBence Jones Tubulare Screening per ricerca proteina di BJ
· Una miscela di antisieri anti C Kappa e Lambda ( libere e legate) e anti alfa1-microglobulin IFE su gel agarosio con una corsa elettroforetica / campione.
· Possibilità di screening su urine non concentrate con risparmio di tempo e costi con colorazione crystal violet.
Dati di Vernocchi A.
Prove di Sensibilità
Agarosio Interlab con anticorpi BIOCI anti CLL Kappa e Lambda
Metodo
Proteina di Bence Jones:
Procedura proposta per Ricerca e Tipizzazione
Secondo campione del mattino.
CAP 24h
Sensibilità consigliata: 10mg/L.
In presenza di gammapatia monoclonale e/o BJ, il parametro più importante è la progressione del quadro clinico.
Quindi è necessaria la determinazione quantitativa della C.M. e/o della BJ.
Proteina di Bence Jones:
Procedura proposta per il Dosaggio
Dosaggio della proteinuria delle 24 ore
(metodo specifico es Rosso di Pirogallolo).
EP (zonale o ad alta risoluzione)
Calcolo percentuale della banda sul tracciato densitometrico
Espressione in g/L del valore in %.
Esempio: Dosaggio
Valore CM (g/L) = Valore % * Proteinuria (g/L)
Limiti del metodo
I metodi di determinazione delle proteine totali urinarie rilevano con difficoltà microproteine e la proteina di BJ: la PT di un campione con PBJ può essere poco accurata.
L’affinità dei coloranti per le diverse proteine è variabile, e non è provato che ad intensità uguali corrispondano quantità uguali di proteina.
La PBJ può presentarsi frazionata, difficile isolarla dal tracciato, difficile valutarla densitometricamente, ma gli studi recenti in capillare potrebbero risolvere il problema.
Nonostante i suoi limiti, questa tecnica, secondo il CAP e la SIBioC, è l’unica utilizzabile in caso di richiesta di quantificazione della PBJ, non essendo disponibili valide alternative.
Proteina di Bence Jones:
Dosaggio immunometrico di k e l totali
Maggior ripetibilità e standardizzazione.
Permette di dosare anche le PBJ che migrano sotto proteine specifiche eventualmente presenti.
Pero’…
Curva di taratura fatta con k e Lambda policlonali, che rendono impreciso il dosaggio di una monoclonale:
Viene a mancare il requisito essenziale per un test immunologico: il parallelismo tra l’antigene del calibratore e l’antigene del campione.
Non ripetibile e impreciso in presenza di aggregati.
QUANTIFICAZIONE
Conclusione
· La quantificazione della proteina di BJ riveste una certa importanza nella diagnostica differenziale delle condizioni associate a presenza di componente monoclonale (CM) e nel monitoraggio di questi pazienti.
· Questo è tuttavia un problema che non è risolvibile con le attuali tecniche di laboratorio.
Limiti della procedura
· Nonostante i problemi segnalati, la procedura densitometrica proposta dal CAP è l’unica utilizzabile in caso di richiesta di quantificazione della PBJ, non essendo disponibili valide alternative.
· E’ tuttavia consigliabile che il follow-up sia eseguito sempre nello stesso laboratorio per minimizzare la variabilità analitica.
· Resta da segnalare che gli studi attualmente in corso sull’utilizzo della elettroforesi capillare, potrebbero portare ad una soluzione del problema.
Linee guida per la diagnosi ed il monitoraggio del MM:
un aggiornamento
· Dalla pubblicazione (2009) delle linee guida del IMWG per FLC, numerose linee guida per la diagnosi ed il monitoraggio del MM e discrasie correlate sono state aggiornate e sviluppate.
· Nessuna di queste linee guida (locali o internazionali) raccomanda di escludere l’elettroforesi urinaria o l’immunofissazione urinaria dall’algoritmo diagnostico iniziale.
We realize that the strong pressure to reduce laboratory costs makes our approach difficult to sustain, but we believe that new, less expensive technologies/procedures should be adopted only if they provide optimal clinical efficacy.
“We cannot afford missing the diagnosis of a single patient with malignant monoclonal gammopathy”.
G Merlini et al.. Clin Chem Lab Med 2001;39:1025-28
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